Звездчатые клетки печени (жиронакапливающие клетки, липоциты печени, или клетки Ито), локализующиеся в пространствах Диссе и содержащие ретиноиды, привлекают внимание исследователей - гистологов, физиологов, гепатологов на протяжении более 130 лет, но лишь в последние годы, после значительного прогресса методов структурного исследования, появились доказательства их роли в фиброгенных процессах печени [1, 3, 4, 6, 7, 12, 14].
В настоящее время функции звездчатых клеток печени связывают не только с поражением печени, но и с развитием, регенерацией печени, реакцией на воздействия ксенобиотиков и иммунорегуляцией. Разрабатываются аспекты необходимого участия звездчатых клеток печени в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток печени [15]. Звездчатые клетки рассматриваются как необходимое звено в пространстве Диссе, участвующее в тонкой регуляции аутокринных и паракринных стимулов, в быстром ответе на изменения компонентов экстрацеллюлярного матрикса и адекватном реагировании на метаболические потребности, возникающие в онтогенезе. Более того, жизненно важная функция поддержания системного гомеостаза связана с депонированием и мобилизацией ретиноидов, их способностью презентации антигенов и индукции толерантности, так же как с определенными взаимоотношениями с потомками костномозговых клеток [9]. Интерес к этому типу клеток неуклонно возрастает, с ними связаны определенные надежды более глубокого понимания физиологии печени, а также диагностики и лечения патологических процессов [5, 10, 11].
Цель работы - исследование количественно-качественных изменений популяции звездчатых клеток печени крыс Вистар в онтогенезе.
Материал и методы исследования
Проведен сравнительный анализ популяции звездчатых клеток печени у 38 крыс-самцов Вистар массой тела от 110 до 480 г 4-х возрастных групп: 4, 9, 12 и 24 мес. (10, 10, 9 и 9 животных соответственно). На всех этапах были учтены Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977).
Образцы печени фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2-7,4); парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000B (Германия). Ультратонкие срезы, контрастированные уранилацетатом и цитратом свинца, исследовали в электронном микроскопе «JEM 1010» при ускоряющем напряжении 80 кВт.
Стереологический анализ образцов печени проводили на электронограммах с использованием методов, основанных на подсчете числа пересечений тестовой линии с ее границами [2]. Ультраструктурный стереологический анализ включал определение поверхностной плотности цитоплазматических органелл звездчатых клеток. Тестовая система состояла из циклоидов суммарной длиной 45 мкм и 70 тестовых точек [8]. При статистической обработке данных применяли критерий Стьюдента; различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки P была меньше 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В образцах печени звездчатые клетки были хорошо видны лишь на полутонких и ультратонких срезах и дифференцировались в пространствах Диссе по наличию в цитоплазме крупных липидных капель. При электронно-микроскопическом исследовании печени 4-месячных крыс Вистар звездчатые клетки содержали немногочисленные крупные электронно-прозрачные или умеренно осмиофильные липидные капли, вместе с округлым эухромным ядром занимающие почти всю цитоплазму. Перинуклеарно, между липидными капелями, локализовалось минимальное количество мембранных органелл - одиночные мелкие митохондрии с плотным матриксом и редкими кристами и короткие профили гранулярной цитоплазматической сети.
В ультраструктурной организации гепатоцитов крыс данной возрастной группы обращало на себя внимание множество розеток гликогена. Среди цитоплазматических органелл наиболее многочисленны митохондрии, компактно группирующиеся в различных участках цитоплазмы, характеризующиеся большим числом, мелкими размерами и достаточно осмиофильным матриксом, что свидетельствовало в пользу пролиферации митохондрий. В гепатоцитах слабо представлены элементы гранулярной цитоплазматической сети, преобладали свободные рибосомы и полисомы, значительно гиперплазированы микроворсинки синусоидального полюса. В целом, комплекс ультраструктурных особенностей соответствовал ювенильному фенотипу.
В печени крыс в возрасте 9 и 12 мес. сохранялось большое содержание гликогена, нарастающее в порто-центральном направлении, при этом отмечены различной степени выраженности эозинофилия цитоплазмы части гепатоцитов и умеренная мононуклеарная инфильтрация портальных трактов. На полутонких срезах обнаружена очаговая метахромазия межклеточного матрикса, отражающая ремоделирование соединительной ткани в динамике онтогенеза.
У крыс Вистар в возрастной группе 9 мес. наиболее четко выявлялся зональный полиморфизм звездчатых клеток. Он выражался в наибольшей численной плотности липоцитов в перипортальной зоне печеночной дольки с постепенным ее уменьшением и почти полным отсутствием в перицентральных зонах. При электронно-микроскопическом исследовании центролобулярные и перицентральные звездчатые клетки содержали очень мелкие немногочисленные липидные включения, иногда с признаками деградации. Вокруг центральных вен выявлялись лишь фибробластоподобные клетки, своим ультраструктурным фенотипом не отличающиеся от клеток, продуцирующих компоненты внеклеточного матрикса непосредственно в стенке центральных вен.
В возрасте 12 мес. приблизительно четверть центролобулярной популяции звездчатых клеток печени приобретала переходный фенотип с увеличением площади цитоплазмы и одновременным присутствием и крупных липидных включений, и более развитого белоксинтезирующего компартмента. Деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом с последующей элиминацией экзоцитозом. Перинуклеарно локализовались канальцы гранулярной цитоплазматической сети и приуроченные к ним мелкие митохондрии, в ядрах формировались крупные ядрышки, что свидетельствовало об индукции синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса, ремоделирующих пространства Диссе.
В данной возрастной группе при электронно-микроскопическом исследовании выявлены признаки дегенеративно-дистрофических процессов в паренхиматозных клетках печени: многочисленные гранулы липофусцина (маркер гипоксии и/или старения клеток), гетерогенные лизосомы и полиморфные резидуальные тельца. Митохондрии были многочисленны, но приобретали более крупные размеры и полиморфизм; матрикс митохондрий менее осмиофилен; кристы редкие, очень тонкие, хаотично ориентированные. Отмечалась гетерогенность гепатоцитов по наличию фокусов внутриклеточной регенерации (скоплений параллельных профилей гранулярной цитоплазматической сети в ассоциации с митохондриями).
Печень крыс в возрасте 24 мес. характеризовалась умеренно выраженной дискомплексацией печеночных трабекул и полиморфизмом паренхиматозных клеток: неравномерным включением гликогена в пределах долек, ацидофильной и липидной дегенерацией перипортальных и перицентральных гепатоцитов, опустошенностью цитоплазмы части гепатоцитов. Наблюдались фиброз центральных вен и неравномерное расширение преимущественно перицентральных синусоидов.
При ультраструктурном исследовании выявлено ремоделирование пространств Диссе с очаговым развитием перигепатоцеллюлярного фиброза - с коллагеновыми фибриллами, локализованными также вдоль латеральных полюсов гепатоцитов. Возрастающее количество фибриллярных структур обусловливало формирование базальной мембраны эндотелиоцитов («капилляризацию» синусоидов) с изменением фенотипа микрососудистой выстилки: эндотелиальные клетки утрачивали фенестры и содержали лишь единичные пиноцитозные везикулы.
Звездчатые клетки печени у крыс в возрасте 24 мес. характеризовались значительной гетерогенностью ультраструктурной организации: среди них липидосодержащие и фиброгенные клетки, при этом большинство популяции звездчатых клеток имело переходный фенотип. Наряду с крупными липидными каплями видны свободные рибосомы и мембранные органеллы - митохондрии, элементы гранулярной и гладкой цитоплазматической сети, везикулы комплекса Гольджи, а также резидуальные структуры, отражающие процесс фокальной внутриклеточной деградации. Отмечено появление двуядерных звездчатых клеток.
В паренхиматозных клетках печени крыс в возрасте 24 мес. обнаруживалась полиморфная липидная инфильтрация, сниженное содержание гликогена, формирование аутофагосом и многочисленных резидуальных телец. Митохондрии уменьшены в количестве, крупные, с единичными кристами и гомогенным, умеренно электронно-плотным матриксом, с мелкими осмиофильными гранулами, патогномоничными для гипоксии и интоксикаций различного генеза.
Стереологический анализ ультраструктурной организации звездчатых клеток печени крыс в онтогенезе продемонстрировал уменьшение поверхностной плотности липидных включений, имеющее достоверные отличия (р < 0,05) в возрасте 24 мес.: 4 мес. - 376,8 ± 21,2 м2/см3; 9 мес. - 396,8 ± 11,6; 12 мес. - 286,3 ± 13,5 и 24 мес. - 243,3 ± 12,7 м2/см3. Соответствующие четырем возрастным группам показатели поверхностной плотности профилей гранулярной цитоплазматической сети звездчатых клеток печени демонстрировали неуклонный рост: 28,1 ± 4,3; 32,4 ± 5,1; 38,9 ± 6,2 и 52,7 ± 4,9 м2/см3. Таким образом, в динамике онтогенеза в звездчатых клетках печени выявлены ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов, оцениваемой по поверхностной плотности липидных капель. Это свидетельствует о том, что в динамике онтогенеза при снижении энергетического потенциала гепатоцитов у крыс в возрасте 24 мес. синхронно индуцируется фиброгенная трансформация звездчатых клеток печени, обусловливающая инволютивные изменения и фиброзную трансформацию печени.
Нарушения функций митохондрий играют ключевую роль в старении клеток; в процессе онтогенеза в клетках изменяется как относительное количество митохондрий, так и их качество, определяемое, прежде всего, их способностью продуцировать АТФ. Следствием окислительного стресса являются угнетение дыхания, имеющее структурное выражение в набухании митохондрий. Повреждение митохондриальных крист, характерное для «старых» митохондрий, может быть ответственным за снижение трансмембранного потенциала [13]. Можно полагать, что нарастающее нарушение функций митохондрий гепатоцитов ведет к развитию дефицита энергии, в условиях которого баланс в «системе про- и антиоксиданты» в тканях крыс сдвигается в пользу первых, и развивается окислительный стресс, являющийся индуктором фиброгенной активности звездчатых клеток печени. В целом, альтерация гепатоцитов в связи с нарастающим в онтогенезе развитием окислительного стресса является одним из факторов индукции фиброгенной активации звездчатых клеток печени.
Заключение
В онтогенезе крыс Вистар центральным событием ремоделирования пространств Диссе является активация звездчатых клеток печени, превращение их из липоцитов, накапливающих витамин А, в фиброгенные клетки. Липидонакапливающие звездчатые клетки характеризуются выраженным полиморфизмом по размерам, форме, количеству липидных капель и их тинкториальным свойствам.
В онтогенезе у крыс при постепенном развитии внутридолькового фиброза ультраструктура звездчатых клеток печени приобретала смешанный, или переходный, фенотип - одновременное присутствие морфологических признаков и липидосодержащей, и фибробластоподобной клетки. В переходных звездчатых клетках при сохранении одиночных липидных капель увеличивался объем цитоплазмы и активизировалась белоксинтезирующая функция с увеличением количества свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цитоплазматической сети. Деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом.
В динамике онтогенеза у крыс Вистар в звездчатых клетках выявлены ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов, оцениваемой по поверхностной плотности липидных капель. Прогрессирующие дисфункции митохондрий гепатоцитов и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами фиброза печени у крыс в возрасте 24 мес.
Рецензенты:
Богатова Н.П., д.б.н., профессор, зав. лабораторией ультраструктурных исследований НИИ института клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМЕ, г. Новосибирск;
Вавилин В.А., д.м.н., профессор, зав. лабораторией метаболизма лекарств НИИ молекулярной биологии и биофизики, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 19.09.2011.