Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Важнейшей проблемой современной медицины стало массовое распространение лекарственной устойчивости у условно-патогенных бактерий и грибов.

Одним из решений этой проблемы является создание новых антимикробных лекарственных препаратов и разработка способов преодоления их лекарственной устойчивости.

Кроме того, современное состояние фармацевтического рынка (из-за присутствия большого количества дженериков) часто дезориентирует врача в плане выбора оптимального антибиотика, а высокая стоимость наиболее эффективных из них уменьшает спектр используемых антимикробных средств и часто обусловливает возврат к уже апробированным, ставшими «традиционными», препаратам, применение которых уже не дает ожидаемых результатов.

Выбрать идею (направление исследований) помог случай, когда по ошибке диски с антибиотиками были помещены на поверхность свежеприготовленной питательной среды Эндо с культурой полирезистентного штамма лактозонегативных эшерихий (среда была схожа по цвету с мясопептонным агаром и чашки Петри с ней не были промаркированы лаборантом). Интерес вызвали необычно большие диаметры зон задержки роста культуры: для тетрациклина - 52 мм, эритромицина (к которому штамм был резистентен) - 19 мм. Полученные данные о потенцировании действия антибиотиков в использованных условиях проведения опыта побудили нас рассмотреть компоненты питательной среды Эндо на предмет синергидного действия с препаратами тетрациклинового, пенициллинового ряда, макролидами и левомицетином (к ним большинство условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных в г. Самаре, были резистентны). Таковым оказался фуксин.

Цель исследования - создание универсального способа преодоления лекарственной резистентности микробов на основе комбинированного применения антимикробных препаратов (к которым микробы резистентны) в средних терапевтических дозах и анилиновых красителей (метиленового синего, бриллиантового зеленого и фуксина) в субингибирующих концентрациях.

Материал и методы исследования

Чувствительность условно-патогенных микробов к различным вариантам комбинированных антимикробных рецептур определялась у 1062 антибиотикорезистентных штаммов диско-диффузионным методом, руководствуясь общепринятыми методиками [3; 4], инструкциями производителей бумажных дисков.

Красители (метиленовый синий, бриллиантовый зеленый, фуксин) вводили в расплавленные плотные питательные среды при температуре 45‒46 °С. Разведения метиленового синего и бриллиантового зеленого готовили в стерильной дистиллированной воде, начиная с 1 % растворов. Фуксин разводили в этаноле (96 %) до концентрации 1 %, последующие разведения производили стерильной дистиллированной водой и сразу же добавляли в питательную среду.

При подборе субингибирующих концентраций красителей в питательном агаре делали лунки с помощью фламбированных металлических цилиндров диаметром 10 мм. Затем дно лунок заливали той же питательной средой (слоем 1‒1,5 мм) в целях предупреждения затекания раствора красителя под агаровую пластинку в чашке Петри. Измерение диаметров зон подавления роста микробов проводили штангенциркулем.

Для планирования эксперимента по выбору оптимального соотношения антимикробного препарата и анилинового красителя использовали метод оптимизации процесса по схеме ортогональных латинских прямоугольников: 2 фактора на трех уровнях [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Исследования планировалось провести в два этапа:

- на первом предстояло выбрать ориентировочные минимальные подавляющие концентрации анилиновых красителей для математического планирования последующих экспериментов;

- на втором установить оптимальные концентрации красителей с помощью метода ортогональных латинских прямоугольников.

1-й этап

При проведении экспериментов было также установлено, что различные штаммы одного и того же вида бактерий имеют различия в минимальных подавляющих концентрациях (мпк) анилиновых красителей, поэтому в табл. 1 приведены минимальные и максимальные величины.

Таблица 1

Значения мпк анилиновых красителей в отношении бактерий и грибов, %

Как видно из табл. 1, для большинства исследованных микроорганизмов межштаммовые различия в мпк анилиновых красителей незначительны (не более, чем в 2 раза). Обращает на себя внимание необходимость использования для подавления роста этих микробов и энтеробактеров более высоких концентраций фуксина и бриллиантового зеленого, чем в отношении стафилококков и коринебактерий.

Учитывая, что при математическом планировании экспериментов будет использовано несколько уровней концентраций анилиновых красителей, представленные в табл. 1 данные указывают на целесообразность выбора в качестве «средних» величин следующих значений: для бриллиантового зеленого - 0,00063 %; для метиленового синего и фуксина - 0,00125 %.

2-й этап

Для антибиотиков и других антимикробных лекарственных средств в качестве уровней их концентрации в жидкой питательной среде выбрали следующие значения:

- минимальные, соответствующие средним терапевтическим дозам (к ним микроб чувствителен);

- средние, соответствующие максимальным терапевтическим дозам (к ним микроб промежуточен по чувствительности);

- максимальные (при них микроб считается резистентным).

При проведении экспериментов с использованием плотной питательной среды в качестве среднего уровня содержания антимикробных препаратов были приняты 20 мг (соответствует таковому в стандартных бумажных дисках). Минимальные и максимальные отличались от среднего в 2 раза.

Результирующим признаком выбрали величины зон подавления роста полирезистентных клинических изолятов бактерий (золотистого и эпидермального стафилококка, коринебактерий, клебсиеллы, энтеробактера) и грибов Candida albicans на плотной питательной среде, мм, при использовании бумажных дисков с различным содержанием антимикробного препарата, либо количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл жидкой питательной среды через 1 сутки культивирования.

Полученные результаты в табл. 2‒4 показывают, что увеличение содержания антимикробных препаратов приводило к повышению ингибирования роста различных микроорганизмов (исключение составляло только действие левомицетина в жидкой питательной среде). В плотной питательной среде такое же явление наблюдалось в действии на бактерии анилиновых красителей, сочетавшихся с цефазолином, тетрациклином и фурагином. А у красителей закономерности «доза - эффект» не наблюдалось. Это было дополнительным доказательством, что выбранные концентрации данных веществ действительно были субингибирующими и самостоятельного антимикробного действия не проявляли.

Таблица 2

Результаты эксперимента с бактериями по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в плотной питательной среде, мм

Примечания:

1. Количество повторностей опыта - 3.

2. БрЗ - бриллиантовый зеленый, МС - метиленовый синий.

Таблица 3

Результаты эксперимента с бактериями по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в жидкой питательной среде, в колониеобразующих единицах

Примечания:

1. Количество повторностей опыта - 3.

2. БрЗ - бриллиантовый зеленый, МС - метиленовый синий, Ф - фуксин.

Таблица 4

Результаты эксперимента с грибами Candida albicans по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в плотной питательной среде, мм

Примечание. Количество повторностей опыта - 3.

Основываясь на полученных данных, было принято решение - применять в последующих исследованиях анилиновые красители в максимальных (из испытанных) субингибирующих концентрациях (местно) и минимальных (парентерально и per os): метиленовый синий - 0,0025 % (местно) и 0,00063 % (парентерально и per os); бриллиантовый зеленый - 0,00125 % (местно); фуксин основной - 0,0025 % (местно).

Выводы

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан новый способ преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам с различным механизмом действия путем их комбинированного применения с анилиновыми красителями. При этом один компонент (вспомогательный, т.е. анилиновый краситель, применяемый в субингибирующей концентрации) обеспечивает эффективность другого (основного, к которому резистентен микроорганизм). Отмечается синергидное взаимодействие компонентов комбинированного препарата [2].

Нами сформулированы основные положения разработанного способа преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов:

1. Потенцирование действия антимикробных препаратов, к которым устойчивы микробы, путем их совместного применения с анилиновыми красителями.

2. Использование красителей в субингибирующих концентрациях, при которых отсутствует их самостоятельное антимикробное действие.

3. Универсальность, заключающаяся в возможности преодоления резистентности различных микроорганизмов (бактерий, грибов) к препаратам разных групп (антибиотикам, фторхинолонам, нитрофуранам, антимикотикам).

Рецензенты:

Кулагин О.Л., д.м.н., профессор, профессор кафедры фармакологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Самара;

Жестков А.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Самара.

Работа поступила в редакцию 10.08.2011.