Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

FEATURES OF TNF-α-INDUCED APOPTOSIS IN PATIENTS

Хараева З.Ф., Иванова М.Р., Шевченко А.А.
Проведено изучение показателей ФНО-индуцированного апоптоза в сыворотке крови пациентов с хроническими вирусными гепатитами и герпетической инфекцией. ФНО-α зависимые пути противовирусной защиты активированы во всех исследуемых группах больных с хроническими вирусными инфекциями, при этом уровень ФНО-α является показателем активности воспаления и коррелирует с тяжестью течения инфекционного процесса, что позволяет использовать его в качестве диагностического критерия при скрытых инфекциях. Уровень TRAIL снижен при ВПГ-1,2, ХВГВ и ХВГС и не изменен при цитомегаловирусной инфекции.
The study of the TNF- α-induced apoptosis in the blood serum of patients with chronic virus hepatitis and herpes infection was done. TNF-α dependent path of antiviral protection activated in all studied groups of patients with chronic virus infections, the level of TNF-α is an indicator of inflammation activity and correlates with the severity of the infection process, that allows to use it as a diagnostic criterion for the hidden infections. The TRAIL reduced by HSV-1,2 chronic virus hepatitis and not changed by cytomegalovirus infection. Keywords: TNF- α, apoptosis, virus hepatitis, herpes infection

Фактор некроза опухоли (ФНОα) - один из основных цитокинов, способных оказывать прямое повреждающее действие на клетки-мишени и лизировать клетки, инфицированные вирусом [1, 4, 6]. ФНОα является необходимым и в то же время достаточным индуктором местных и системных воспалительных реакций [4, 5, 6]. Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетки к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства фактора некроза опухоли со специфическими рецепторами [5, 7, 8, 11, 13]. При хронических вирусных инфекциях апоптоз может являться как защитным, так и повреждающим фактором [2]. Исследование активности апоптоза и изучение путей регуляции программируемой смерти клетки должны служить основой для подбора патогенетической терапии.

Целью исследования было изучение показателей ФНО-индуцированного апоптоза в сыворотке крови пациентов с хроническими вирусными гепатитами и герпетической инфекцией.

Материалы и методы исследования

Под наблюдением находились пациенты с вирусными парентеральными гепатитами и герпетической инфекцией. 113 больных хроническими вирусными гепатитами в возрасте от 18 до 76 лет проходили стационарное лечение в ЦПБ СПИД и ИЗ МЗ КБР. Преобладали лица мужского пола (88 %). Из них - 76 больных с хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) и 37 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС). При хроническом гепатите В длительность заболевания к моменту поступления составляла 7,8 года, при хроническом гепатите С - 11,2 года. Из числа всех обследованных 48 % пациентов были парентеральными потребителями наркотиков. У 75 % пациентов отсутствовали указания на перенесенный острый гепатит в анамнезе. Все пациенты распределялись по уровню клинико-биохимической активности: 22 больных с минимальной активностью (0-1N АлТ), 57 - с умеренной степенью активности (2-4N АлТ) и 34 - с высокой степенью активности (> 4N АлТ). Больные получали симптоматическое лечение без включения противовирусных препаратов. Диагноз был выставлен на основании клинико-эпидемиологической и молекулярно-биохимической оценки. Всем пациентам проводилось определение маркеров вирусных гепатитов методом ИФА (тест-системы «Вектор-Бест», Россия), ДНК-ВГВ, РНК-ВГС, РНК-ВГД методом полимеразной цепной реакции с использованием тест-систем «АмплиСенс» (ЦНИИЭ, Москва), генотипирование вирусов проводилось методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

С хронической рецидивирующей генитальной герпесвирусной инфекцией (ВПГ-1,2) наблюдались 70 пациентов (48 женщин, 22 мужчин). Критериями выбора пациентов для обследования являлись:

1) наличие различной частоты рецидивов генитального герпеса - от 2 до 12 и более раз в год;

2) продолжительность генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года;

3) обследование в фазе обострения процесса или в периоде продромы (не более 48 часов от момента появления высыпаний);

4) отсутствие приема иммуномодулирующей терапии в течение последних 3 месяцев.

Диагноз ВПГ-1,2 был верифицирован на основании клинической картины и данных лабораторного обследования, согласно рекомендациям 5-го международного форума (IHMF-1997) по диагностике генитального герпеса. По тяжести клинического течения ВПГ-1,2 инфекции легкая форма (1-2 рецидива в год) диагностирована у 10 пациентов (22,5 %) исследуемой группы, средняя (3-5 рецидива в год) - у 40 (70,83 %), тяжелая (6-12 и более рецидивов в год) - у 20 (6,67 %).

Также наблюдались 40 человек с диагностированной цитомегаловирусной (ЦМВИ) инфекцией, из них 29 женщин и 11 мужчин. ЦМВИ в основном была выявлена при клинико-лабораторном обследовании при выявлении причин бесплодия (25 %) и привычного невынашивания беременности (20 %), 5 % пациентов имели жалобы на частые рецидивирующие респираторные инфекции (от 4 до 8 раз в год).

Оценку содержания сывороточного растворимого Fas-рецептора (sFas) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартной тест-системы human sAPO-1/Fas ELISA BMS245 (Bender MedSystems). Определение уровня TRAIL в сыворотке крови также проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартной тест-системы human TRAIL ELISA (Biosource). Исследование уровня фактора некроза опухоли α (ФНОα) в сыворотке крови пациентов проводили с помощью тест-системы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Россия). Все пробы исследовались в динамике (в течение 30 дней): с момента поступления в стационар (или рецидива инфекции) и спустя месяц после проводимой комплексной терапии (с подключением ациклических нуклеозидов и иммуномодуляторов - препаратов интерферонов и индукторов интерферонов). Результаты проведенных исследований обработаны с помощью компьютерных программ «Microsoft Exell» и «Statistica» с применением метода вариационной статистики, регрессивного и корреляционного анализа.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении ФНО-индуцированного апоптоза у больных вирусным гепатитом В были выявлены следующие закономерности. При поступлении в стационар у больных с гепатитом В отмечалось существенное повышение концентрации ФНО α и sFas (p > 0,01) (таб. 1). На 30-е сутки после поступления на фоне комплексной терапии показатели sFas достоверно снижались, но не приходили в норму. Уровень провоспалительного иммуноцитокина ФНО α, несмотря на проведенную комплексную терапию, на 30 сутки выше, чем при поступлении в стационар (p < 0,01). У больных хроническим вирусным гепатитом С отмечались однонаправленные с пациентами с ХВГВ, но более выраженные изменения концентрации sFas. В отличие от полученных повышенных показателей sFas и ФНО в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами, концентрация TRAIL во всех периодах обследования в при ХВГВ и ХВГС была достоверно снижена (p < 0,01) (табл. 1).

Таблица 1

Показатели содержания ФНО-α, sFas и TRAIL в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами, (пг/мл)

Группа пациентов

Показатель

При поступлении
в стационар

Через 30 суток

Вирусные гепатиты

ХВГВ

ФНО α (n = 30; 17)

55,0 ± 1,61,3

64,0 ± 2,11,2,3

sFas (n = 46; 22)

1739,0 ± 64,71,3

1652,0 ± 123,51,3

TRAIL (n = 29;18)

119 ± 13,01,3

107 ± 16,21

ХВГС

ФНО α (n = 20;14)

41,0 ± 3,31

35,0 ± 1,21

sFas (n = 20;15)

2366,0 ± 85,71

2317 ± 74,61

TRAIL (n = 15;11)

55 ± 19,61

78 ± 22,41

Здоровые доноры (n = 15)

ФНО α

18,0 ± 2,0

-

sFas

1250,5 ± 135,5

-

TRAIL

199 ± 5,3

-

Примечания:

1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р < 0,01;

2 - достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р < 0,01,

3 - достоверность различий к показателям у больных ХВГС, р < 0,01.

При исследовании пациентов с ВПГ 1,2 - инфекцией отмечалось повышение уровня sFas в момент рецидива при легкой степени на 42 %, средней степени тяжести на 35 %, тяжёлой степени на 26 % (табл. 2). Через 30 суток, на фоне проводимой терапии уровень sFas значительно снизился, но превышал уровень контрольной группы (р < 0,01). При ЦМВИ в момент рецидива значение sFas на 75 % выше уровня контрольной группы и сохраняет свой уровень повышенным на 15 % через 30 суток с момента лечения (р < 0,01).

Таким образом, при различных типах герпетической инфекции активируется способность организма элиминировать вирус. В то же время способность к запуску апоптоза зараженных клеток при тяжелых формах ВПГ-1,2 инфекции меньше, чем при более легких формах (средней и легкой степени тяжести). Сывороточные концентрации TRAIL оказались близки к нормальным значениям лишь в группе пациентов с ВПГ-1,2 легкой степенью тяжести и ЦМВИ. Обращает на себя внимание выявленная тенденция к снижению TRAIL в сыворотке крови в случаях с более тяжелым течением инфекционного процесса (см. табл. 2).

Определение роли участия растворимых форм мембранных молекул иммунных клеток и активации апоптоза в патогенетическом механизме развития хронических вирусных инфекций с высоким онкогенным риском является одним из этапов изучения патогенетической роли апоптоза при интегративной вирусной инфекции. Повышение концентрации ФНО-α в сыворотке крови при вирусных гепатитах было обнаружен во многих исследованиях, как маркера некробиотических процессов, развивающихся в ткани печени [3]. Наиболее высокие показатели получены у больных хроническим вирусным гепатитом В, что, по-видимому, отражает преобладание некротических процессов над апоптическими механизмами у этой группы пациентов, о чем косвенно свидетельствуют более низкие показатели sFas и высокие TRAIL у больных этой группы. Снижение интенсивности апоптоза, возможно, косвенно подтверждает и более высокий онкогенный потенциал этого вируса. С другой стороны, более высокое содержание sFas и низкое - TRAIL в сыворотке крови у больных хроническим вирусным гепатитом С может свидетельствовать об интенсивности образования домена смерти DR-5, который активно связывает TRAIL, в связи с чем снижается его концентрация в сыворотке крови. В процессе апоптоза происходит гибель и этих клеток, в связи с чем может повышаться концентрация Fas-лиганда, что лишний раз обосновывает необходимость исследования маркеров апоптоза в различных биологических объектах, помимо сыворотки крови.

Таблица 2

Фактор некроза опухоли-α и растворимый лиганд sFas в сыворотке крови пациентов
с герпетической инфекцией, пгмл

Группа
пациентов

sFas

ФНО-α

TRAIL

В момент
рецидива

Через 30 сут.

В момент рецидива

Через
30 сут.

В момент рецидива

Через
30 сут.

ВПГ-1,2 типа

Легкая степень

1780,0 ± 120,0¹

1380,0 ± 110,0

38,0 ± 2,0¹

24,0 ± 2,0

189,5 ± 13,0

157,5±16,01,2

Средняя степень

1880,0 ± 110,0¹

1780,0 ± 100,0¹

42,0 ± 4,0¹

30,0 ± 3,0¹

154,5 ± 13,01

105,0±9,21,2

Тяжелая степень

1820,0 ± 130,0¹

1680,0 ± 140,0¹

45,0 ± 5,0¹

32,0 ± 3,0¹

129,0 ± 13,01

100,0±6,01,2

ЦМВИ

2150,0 ± 170,0¹

1450,5 ± 115,5¹

25,0 ± 2,0

21,0 ± 1,0

179,5 ± 10,0

180,5 ± 15,0

Доноры

1250,5 ± 135,5

-

18,0 ± 2,0

-

199,0 ± 5,3

 

Примечание. ¹Достоверность различий (р < 0,01) по сравнению с контрольной группой.

При герпетической инфекции наиболее выраженные изменения выявлены при тяжелых формах течения ВПГ-1,2 типа. Причинами тяжелого течения инфекционного процесса могут служить сниженный иммунитет и угнетение защитных противовирусных апоптозозависимых процессов. В крови отмечено повышение количества sFas. Полученные результаты можно объяснить лимфотропным действием вируса, так как продуктивная вирусная инфекция приводит к гибели лимфоцитов, что может являться также одной из причин повышения sFas [1]. Таким образом, наиболее выраженные изменения апоптоза обнаружены при хронических гепатитах с парентеральным механизмом инфицирования и герпетической инфекцией средней и тяжелой степеней тяжести. ФНО-α зависимые пути противовирусной защиты активированы во всех исследуемых группах больных с хроническими вирусными инфекциями, при этом уровень ФНО-α является показателем активности воспаления и коррелирует с тяжестью течения инфекционного процесса, что позволяет использовать его в качестве диагностического критерия при скрытых инфекциях.

Работа поддержана федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы», (НК-193П)

Список литературы

  1. Барышников. А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. - М.: Наука, 2002. - 327 с.
  2. Белушкина Н.Н. Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2005. - 32 с.
  3. Котович М.М. Роль этиотропной и патогенетической терапии в клинической и морфологической эволюции хронических гепатитов у детей: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - М., 2003. - 27 с.
  4. Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов А.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. - 2007. - № 4. - С. 249-253.
  5. Bodmer J. TRAIL receptor-2 signals apoptosis through FADD and caspase-8 // Nature Cell Biology. - 2000. - Vol. 2. - P. 241-243.
  6. Guo Y., Srinivasula S.M., Druilhe A. et al. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria // J. Boil. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 13430-13437.
  7. Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M. et al. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex // Mol.Cel. Biol. - 2003. - Vol. 23, № 4. - P. 1428-1440.
  8. Huang X., Lin Т., Gu J. et al. Combined TRAIL and Bax gene therapy prolonged survival in mice with ovarian cancer xenograft // Gene Ther. - 2002. - Vol. 9(20). - P. 1379-1386.

Рецензенты:

Михальчик Е.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биофизических методов исследования НИИ Физико-химической медицины, г. Москва;

Иванов А.Б., д.б.н., профессор, зав. кафедрой нормальной и патологической физиологии, «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х. М. Бербекова», г. Нальчик.