Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

Антонова Е.И.

В последние годы усиливается воздействие на организм техногенных и антропогенных факторов, в связи, с чем выявляется опасная тенденция глобальных изменений в окружающей среде. Особое место среди факторов экологической дестабилизации занимают нарушения температурного оптимума, при этом актуальным является изучение морфобиохимических показателей печени, как органа, который непосредственно принимает участие в поддержании гомеостаза организма (de Jong G., 2002, Michael J., 2002, Mora C., 2006). Поскольку максимальное функциональное напряжение организма сопряжено с высокой вероятностью возникновения экстремального состояния, именно первичные реакции, возникающие непосредственно после действия гипертермии, требуют исследования приспособительных реакций, которые отражают мобилизацию в короткий срок защитных сил печени, необходимые для становления процессов компенсации в условиях стресса. В связи с этим целью нашего исследования является выявить характерные изменения в ультраструктуре гепатоцитов, динамике соотношения цитотипов печени, временнóй адекватности, степени выраженности, скорости и топографии развертывания компенсаторно-приспособительных реакций в печени после воздействия гипертермии.

Материалы и методы

Эксперимент поставлен на 30 особях (15 из которых служили контролем) млекопитающих вида Muridae Rattus norvegicus (половозрелые беспородные крысы самцы 2 месяцев постнатального развития). Перегревание животных проводили в воздуховентилируемой камере в течение 20-30 минут с термостатированием температуры 42ºС. Декапитировали животных через час после воздействия. Для морфологических исследований образцы печени фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5%), затем материал дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия заливали в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца, затем просматривали и фотографировали срезы на электронном микроскопе "Hitachi-600H". Морфометрические исследования проводили с использованием программы UTHSCSA ImageTool 3.0. Количественные параметры оценивалась на 100 мкм2 площади паренхимы печени. Иммуногистохимичекое исследование осуществляли на парафиновых срезах печени стрептавидин-биотиновым методом с предварительной демаскировкой методом HIAR (Shi, Key, 1991; Киясов А.П. 1998). После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали с первичными антителами, затем с биотинилированными вторыми антителами конъюгированные с пероксидазой хрена иммуноглобулина кролика против IgG мыши (Link, DAKO LSAB+Kit Peroxidase, разведение 1:100). Выявление клеток Купфера проводили гистохимически реакцией на эндогенную пероксидазу (Маянский, 1992; McPhie, 1979; Burt, Bail, 1993). Пролиферативную активность гепатоцитов выявляли с помощью антител к ядерному антигену PSNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) гепатоцитов (Novocastra, Великобритания, NCL-L-PCNA, P 10, IgG2a, разведение 1:100), клетки Ито окрашивали антителами к десмину (клон D33, разведение 1:50, DAKO, Denmark). Площадь поля, в котором вели подсчет клеток, составляла 0,04 мм2. Статистическую обработку полученного материала осуществляли с помощью пакета прикладных программ "STATISTICA-5". Различия между независимыми выборками определяли с помощью критерия Манн-Уитни (U) и критерию Стьюдента (t). Значимыми различия принимались при Р≤0,05.

Собственные данные

После перегревания цитоплазма гепатоцитов уплотняется, увеличивается объемная плотность ГЭС (0,20±0,07 и 0,40±0,07* мкм3/мкм3). Матрикс у некоторых митохондрий уплотнен, уменьшается объемная (0,30±0,07 и 0,20±0,03* мкм3/мкм3) и поверхностная плотность этих органелл (8,20±1,40 и 6,30±0,30* мкм2/мкм3). Отдельные митохондрии сливаются в гигантские митохондрии. Отмечается топографическая близость липидных капель и митохондрий, выявляется начальные фазы образования липофусциновых гранул и гиперплазия каналов агранулярной эндоплазматической сети. Увеличивается объемная плотность гетерохроматина (0,20±0,049 и 0,30±0,020* мкм3/мкм3). Уменьшается объемная плотность ядрышка (0,20±0,02 и 0,10±0,001* мкм3/мкм3). Увеличивается объемная плотность лизосом (0,02±0,001 и 0,03±0,0* мкм3/мкм3), но численная плотность снижается на 12% (7,9±0,5 и 6,2±0,1* мкм0/мкм3). Также увеличивается объемная (0,04±0,05 и 0,1±0,00* мкм3/мкм3) и поверхностная плотность липидных капель (6,4±0,0 и 12,9±2,0* мкм2/мкм3), по всей видимости, за счет почкования. В цитоплазме не определяются гранулы гликогена. Проявляется гиперплазия агранулярной эндоплазматической сети (0,04±0,05 и 0,10±0,001* мкм3/мкм3). В условиях физиологической нормы в пределах печеночного ацинуса пероксидазо-позитивные клетки Купфера составляют 12,3% и десмин-позитивные клетки Ито 13,2%. Количество PCNA-позитивных гепатоцитов 3,8%, причем большее количество пролиферирующих гепатоцитов выявляется в перипортальной зоне ацинуса. Через час после воздействия гипертермии происходит увеличение количества погибших гепатоцитов на 11,2%, в большей мере в перивенулярной зоне. Количество пероксидазо-позитивных клеток Купфера увеличивается на 12,8%, преимущественно в области портального тракта. Увеличение количества десмин-позитивных клеток Ито происходит на 14,8%, в большей мере в центролобулярной зоне. На 73,6% увеличивается количество PCNA-позитивных гепатоцитов. Увеличение митотической активности происходит в равной мере во всех зонах ацинуса.

Обсуждение полученных данных

Проблема эволюционных преобразований и приспособительных особенностей клеток входит в число важнейших вопросов биологических наук, являясь составной частью фундаментальных исследований эволюции и адаптации организма животных к различным условиям среды (Boutilier R.G., 2000, Hochachka P.W., 2001, Portner H.O. 2002). На ультраструктурном уровне первичная компенсаторная реакция становления гомеостаза, возникающая через час после воздействия гипертермии проявляется в - мозаичности повреждения ультраструктуры гепатоцитов, что свидетельствуют о «неодинаковой реактивности», вследствие чего они неравномерно вовлекаются в физиологический и патологический процессы (Калашникова М. М. 2006). Благодаря перемежающейся активности функционирующих гепатоцитов, различиям в ультраструктуре органелл в одной и той же клетке на ультраструктурном уровне, печень поддерживает активность в условиях стресса. Митохондрии с просветленным матриксом, набухшие, с редуцированными кристами, видимо, отражают их максимальную функциональную активность, которая граничит с дистрофическим состоянием, а также свидетельствует об интенсивном расходовании энергии гепатоцитами, разобщении процессов окисления и фосфорилирования, активизации гликолиза (Калашникова М. М. 2006, Ченцов Ю.С. 2004). Тесный топографический контакт митохондрий с липидными каплями и липофусцином, свидетельствует об их расходовании в ходе β-окисления жирных кислот липидов ферментами митохондрий, что отражает развитие окислительного стресса и сопряженность процессов энергообразования и липогенеза. Увеличение функциональной активности митохондрий отражается на истощении углеводных резервов гепатоцитов и формировании мегамитохондрий. В свою очередь увеличение объемной плотности лизосом, отражает их активацию, а продукты лизосомального протеолиза при дефиците гликогена, могут быть использованы для энергетических и пластических потребностей гепатоцитов. Увеличение количества цистерн ГЭС, проявляет течение ранних этапов внутриклеточной регенерации. Повышение содержания гетерохроматина в ядрах характеризует затухание матричных синтезов, что происходит в соответствии с потребностями гепатоцитов в синтезе РНК и белка, обеспечивая согласование уровней транскрипции и трансляции. Изменение структуры хроматина и ядерного матрикса как следствие повреждения ДНК, а так же выявленное у отдельных митохондрий уплотнение матрикса могут выступать в качестве эндогенных индукторов программируемой клеточной гибели гепатоцитов (Бакеева Л.Е., 2006; Проскуряков С.Я. 2002; Itano N., 2003).

Выявляется сопряженность между количественными стромально-паренхимными показателями печени. Так в условиях физиологической нормы клетки Ито находятся в тесном взаимодействии с гепатоцитами, а аргиназа мембран гепатоцитов может выполнять роль контактного ингибитора, препятствующего активации клеток Ито. Потеря же непосредственных контактов с гепатоцитами, в связи с их гибелью, вызывает активацию клеток Ито по пути усиления экспрессии десмина. В свою очередь, быстрая реорганизация компонентов внеклеточного матрикса, синтезируемых клетками Ито, является важным условием для пролиферации гепатоцитов, которая выявлена нами во всех зонах ацинуса на ранних стадиях регенерации печени. На увеличение пролиферативной активности, по всей видимости, оказывает влияние выброс из поврежденных гепатоцитов TGF-a, запускающий пролиферацию, как клеток Ито, так и самих гепатоцитов. Увеличение активности клеток Ито, которые являются единственным в печени источником HGF, активирует синтез ДНК при повреждении гепатоцитов. В тоже время увеличение количества погибших гепатоцитов является индуктором и для активации тканевых макрофагов в перипортальной зоне ацинуса. Активированные макрофаги синтезируют и секретируют PDGF, который может играть позитивную роль в восстановлении ткани после острого повреждения печени, запуская процесс удаления клеточного детрита паренхимы и реконструкцию межклеточного вещества. Координированное освобождение PDGF вместе с другими факторами роста, является потенциальным стимулом для активации клеток Ито.

Таким образом, однократное воздействие гипертермии уже через час после воздействия инициирует каскад цитокоммуникативных взаимодействий, которые отражают ранний этап репаративной регенерации в пределах печеночного ацинуса. Выявленные ультрамикроскопические изменения структуры гепатоцитов отражают усиление функциональной нагрузки на митохондрии, разобщение процессов окисления и фосфорилирования, активацию гликолиза, активацию реконструктивной функции лизосом, полное истощение запасов гликогена и использование липидов в качестве источников энергии, а так же, активацию путей программируемой клеточной гибели.

Работа представлена на V научную международную конференцию «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Тайланд (Паттайа), 20-28 февраля 2008 г. Поступила в редакцию 26.12.2007.